近年來，造成人類感染性疾病的病原微生物日益復(fù)雜、種類增多，抗菌藥物濫用致使細(xì)菌耐藥，病原微生物已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。

感染是急危重癥患者死亡的主要原因之一。據(jù) WHO 統(tǒng)計(jì)，全球感染性疾病導(dǎo)致的患者死亡占全部死因的 25%以上，每年約 1300 萬兒童死于感染性疾病。在中國，感染性疾病占所有疾病的 50%以上，75%造血系統(tǒng)腫瘤患者和 50%實(shí)體腫瘤患者死于感染，膿毒癥（嚴(yán)重感染）患者病死率高達(dá) 50%。重癥感染起病急、進(jìn)展快、病原體復(fù)雜，基于宏基因組的二代測序（ metagenomics nextgeneration sequencing，mNGS）技術(shù)作為病原微生物的快速檢測手段， 在重癥和疑難病例的病原學(xué)診斷中發(fā)揮了重要作用。

微生物鑒定方法比較

傳統(tǒng)的微生物鑒定方法分為培養(yǎng)和非培養(yǎng)兩類。臨床公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是分離培養(yǎng)和生化鑒定，這種方法的操作周期長、失敗率高，并且不是每種病原體都可以培養(yǎng)。

不依賴培養(yǎng)的方法，比如涂片鏡檢、抗體抗原免疫等，在采樣當(dāng)天即可報(bào)告結(jié)果，這些方法的時(shí)效性強(qiáng)，但在敏感性和特異性上存在較明顯的劣勢，而且傳統(tǒng)的微生物鑒定方法無法快速識別未知或者罕見的病原微生物。

PCR檢測雖然在靈敏度、特異度和檢測時(shí)效上明顯優(yōu)于培養(yǎng)法，但因?yàn)?strong>PCR法基于已知病原菌的基因組序列，所能提供的信息有限，依然不能解決臨床診斷陽性率低的問題。

質(zhì)譜技術(shù)因其高靈敏度、特異性、自動(dòng)化和高通量等特點(diǎn)，被廣泛用于病原微生物蛋白質(zhì)、多肽等的研究。但目前僅能處理培養(yǎng)后菌株等相對單純樣品，難以對原始臨床標(biāo)本中復(fù)雜背景樣品進(jìn)行病原檢測，檢測內(nèi)容也僅限于病原體分型，在生物耐藥性分析和毒力研究等方面進(jìn)展較少。

mNGS 不依賴于傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)，也無需特異性擴(kuò)增，可直接對臨床樣本中的核酸無差別、無選擇性地進(jìn)行高通量測序，與已知微生物序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對到的序列信息來判斷樣本包含的病原微生物種類，能夠快速、客觀地檢測臨床樣本中的病原微生物（包括病毒、細(xì)菌、真菌、寄生蟲）。

檢測方法	優(yōu)點(diǎn)	缺點(diǎn)
培養(yǎng)法	臨床公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，可適應(yīng)較大樣本體積、價(jià)格低廉	檢測敏感度受限于培養(yǎng)時(shí)抗生素的使用、有些微生物難以培養(yǎng)、無法檢測病毒、檢測周期長
免疫學(xué)法	時(shí)效性強(qiáng)，周期1-3天、價(jià)格便宜、操作簡單、可檢測支原體、衣原體、病毒等	敏感性和特異性差、并不是所有病原微生物都有相應(yīng)抗體、有窗口期、假陽性高
核酸檢測（PCR）	簡單、快速、價(jià)格低、可定量檢測、準(zhǔn)確性高	依賴主觀假設(shè)、檢測已知的微生物、需要引物擴(kuò)增，但引物并不總是可靠、只能檢測微生物基因組的很小部分
質(zhì)譜法	過程簡單、特異性和準(zhǔn)確性高、可進(jìn)行高通量分析	基于已培養(yǎng)的陽性菌落，依賴培養(yǎng)、只能檢測細(xì)菌和真菌約1000種已知微生物、部分病原體不能鑒定到種、只能定性不能定量
mNGS	客觀檢測，不依賴假設(shè)、可檢測任意微生物、可以發(fā)現(xiàn)新的病原微生物、可定量檢測核酸、可檢測基因組的任一部分	檢測結(jié)果受宿主背景微生物組成影響、對樣本要求高，易受其他部位樣本污染，易受環(huán)境微生物污染，時(shí)效性不如核酸檢測PCR、檢測價(jià)格高

mNGS流程及存在的問題

病原微生物高通量檢測過程主要包括實(shí)驗(yàn)操作（濕實(shí)驗(yàn)）和生信分析（干實(shí)驗(yàn)）兩個(gè)部分。濕實(shí)驗(yàn)從收到標(biāo)本開始，針對不同的樣本類型進(jìn)行特異處理，提取核酸進(jìn)行文庫構(gòu)建，然后上機(jī)測序；干實(shí)驗(yàn)包括下機(jī)數(shù)據(jù)的分析，去人源宿主序列，比對病原微生物數(shù)據(jù)庫，進(jìn)行種屬鑒定，最后解讀報(bào)告。

?

宏基因組病原體微生物檢測流程

雖然mNGS對罕見病原菌感染的診斷具有優(yōu)勢，可審慎地用于現(xiàn)有成熟檢測技術(shù)不能確定的病原體，或經(jīng)恰當(dāng)與規(guī)范抗感染治療無效的患者。但其技術(shù)仍存在著一些尚待解決的問題：

1、操作流程標(biāo)準(zhǔn)化：mNGS操作流程復(fù)雜，各個(gè)環(huán)節(jié)均易引入污染，干擾檢測結(jié)果，所以在防止污染和質(zhì)量控制方面建立一系列標(biāo)準(zhǔn)化操作程序必不可少。

2、定植菌、背景菌易干擾：檢出的病原體只能代表標(biāo)本中存在這些檢出微生物，無法具體確定是定植菌、背景菌還是致病菌。

3、胞內(nèi)菌/厚壁菌檢出率低：胞內(nèi)感染菌釋放到體液中的含量較少，具有較厚細(xì)胞壁的病原微生物（如真菌）的核酸提取效率較低，可能因檢出序列數(shù)少、微生物豐度低，在檢測報(bào)告中未被列舉。

4、RNA 檢測難度大：人源 RNA 的豐度和復(fù)雜度較高，且易降解，對樣本運(yùn)輸和保存有更高的要求。

5、尚不能完全指導(dǎo)耐藥菌用藥：目前報(bào)道的耐藥基因型與耐藥表型的關(guān)聯(lián)程度還存在一定差距；應(yīng)用 mNGS 對臨床樣本進(jìn)行耐藥相關(guān)基因的分析需要極高的測序深度，成本將增加數(shù)千倍。

應(yīng)用場景

mNGS作為新興的病原體檢測技術(shù)在感染性疾病診斷中的優(yōu)勢及應(yīng)用價(jià)值無需置疑。如何在當(dāng)前微生物檢驗(yàn)流程中找到適合的切入點(diǎn)是 mNGS 向產(chǎn)業(yè)化轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。

樣本類型——病原微生物檢測通常是對病人感染部位取樣檢查，判斷菌種。常用微生物檢查標(biāo)本有血液、尿、痰、胸水、腹水、各種分泌物、各種穿刺液、灌洗液以及鼻咽/口咽拭子等。

適用人群——目前，mNGS 的臨床適用人群定位主要以急危重癥感染患者為主，其主要適應(yīng)證包括：

①病情危重需要盡快明確病原體；

②特殊病人，如免疫抑制宿主、合并基礎(chǔ)疾病、反復(fù)住院的重癥感染患者，需要盡快明確病原體；

③傳統(tǒng)微生物檢測結(jié)果反復(fù)陰性且治療效果不佳；

④疑似新發(fā)病原體、臨床上提示可能有一定的傳染性；

⑤疑似特殊病原體感染；

⑥長期發(fā)熱和/或伴有其他臨床癥狀、病因不明的感染。

感染領(lǐng)域——mNGS技術(shù)在血流感染、中樞神經(jīng)感染、呼吸道感染、不明原因發(fā)熱及肺炎等多領(lǐng)域已得到臨床醫(yī)生認(rèn)可和嘗試使用。

?

血流感染：外周血作為血流感染首選的檢測樣本，mNGS可顯著提高血流感染的精準(zhǔn)診斷效率，縮短了病原診斷時(shí)間，促進(jìn)抗菌藥物的合理應(yīng)用。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染：mNGS在中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)菌性感染方面比傳統(tǒng)檢測方法具有更高的檢出率，且受抗菌藥物影響更小，但不能取代細(xì)菌培養(yǎng)等傳統(tǒng)檢測方法。此外，mNGS在診斷中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核、病毒、特殊病原體（如布魯氏菌）、寄生蟲等病原體感染方面也具有不可替代的優(yōu)勢，而在隱球菌和曲霉等真菌性病原體的檢測需與傳統(tǒng)檢測方法結(jié)合。mNGS檢測也有助于非感染性疾病如自身免疫性腦炎的鑒別診斷，幫助指導(dǎo)用藥。總體來說，mNGS可作為慢性和復(fù)發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染的一線診斷方法，急性腦炎病例的二線診斷方法，推薦將mNGS與常規(guī)微生物檢測手段結(jié)合使用。

呼吸道感染：mNGS可對呼吸道感染提供快速、精準(zhǔn)的病原檢測和鑒定，有效指導(dǎo)抗菌藥物的合理應(yīng)用，避免濫用。mNSG對苛養(yǎng)菌（如結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌、諾卡菌、放線菌、厭氧菌等）、病毒等的檢測靈敏度優(yōu)于或不劣于傳統(tǒng)檢測方法?？傮w來說，mNGS檢測的靈敏度在不同的呼吸道樣本中差異不顯著，但是針對非結(jié)核分枝桿菌的檢測，肺泡灌洗液的檢測靈敏度要優(yōu)于痰液樣本。此外，mNGS在肺部混合性感染的診斷效率優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法。

骨和關(guān)節(jié)感染：針對骨和關(guān)節(jié)感染的患者，滑膜液、植入物的超聲清洗液以及假體周圍的組織都可以用作mNGS檢測的標(biāo)本。尤其推薦微生物培養(yǎng)結(jié)果為陰性、經(jīng)驗(yàn)性抗菌藥物治療效果不佳以及清創(chuàng)效果差的患者使用mNGS進(jìn)行病原檢測。

尿路感染：mNGS在細(xì)菌、真菌性尿路感染方面并不優(yōu)于傳統(tǒng)檢測方法，對于病毒性（如腎移植后多瘤病毒）感染、復(fù)雜性尿路感染診斷方面具有優(yōu)勢。此外，尿液檢測中的限制點(diǎn)在于報(bào)告解讀難度大，遠(yuǎn)端尿道、尿道周圍皮膚以及陰道定植菌會干擾報(bào)告判讀，需要有經(jīng)驗(yàn)的臨床醫(yī)生參與解讀。

消化系統(tǒng)感染：mNGS在腸道病原鑒定中的應(yīng)用較少，其更大的應(yīng)用價(jià)值體現(xiàn)在腸道病原微生物中耐藥基因鑒定，以及識別罕見病毒性肝炎的原因。

復(fù)雜和非典型病原體感染：許多病例已經(jīng)證明了mNGS在鑒定復(fù)雜和非典型病原體感染方面的優(yōu)越性。

免疫功能低下患者：推薦mNGS作為實(shí)體器官移植和造血干細(xì)胞移植患者的一線感染診斷、監(jiān)測工具或作為常規(guī)檢測的補(bǔ)充手段。

不明原因發(fā)熱患者：mNGS已經(jīng)極大提高了不明原因發(fā)熱患者的病原診斷效率，并有望用作發(fā)熱待查患者的一體化診斷測試，用于區(qū)分感染和非感染，以及發(fā)現(xiàn)新發(fā)病原體。

不明原因肺炎：新型冠狀病毒最初由mNGS技術(shù)鑒定出，該技術(shù)對于監(jiān)測和應(yīng)對突發(fā)傳染性疾病具有重要價(jià)值。

新冠助推mNGS乘風(fēng)破浪

2019年12月末，湖北武漢金銀潭醫(yī)院5例重癥肺炎患者的臨床資料和支氣管肺泡灌洗樣本，進(jìn)行mNGS檢測，發(fā)現(xiàn)從未報(bào)告過的、與SARS病毒核苷酸序列相似度達(dá)79%的冠狀病毒。證明了mNGS在突發(fā)傳染病檢測中的重要價(jià)值。

國內(nèi)已有多家提供mGNS微生物檢測服務(wù)的公司，包括華大基因、賽哲生物、金匙基因、譜元科技、杰毅生物、博奧生物、達(dá)瑞生物、永諾生物、微遠(yuǎn)基因、迅敏康、微碼、銳翌生物等。疫情的助推，促使各家企業(yè)在今年紛紛拿到億元級別的融資。

2020 mNGS企業(yè)融資情況

企業(yè)名稱	融資時(shí)間	融資輪次	融資金額	投資機(jī)構(gòu)
華大因源	2020-06-22	股權(quán)融資	4000萬人民幣	高林資本 南海領(lǐng)航 華大基因
微遠(yuǎn)基因	2020-08-12	B輪	2億人民幣	鼎暉投資 中金資本 火山石資本 國科嘉和
杰毅生物	2020-08-01 ? 2020-03-17	A輪 ? ? Pre-A輪	千萬級人民幣 ? ? 近億人民幣	辰德資本 ? ? 比鄰星創(chuàng)投 普華資本 個(gè)人投資者
予果生物	2020-09-28 ? ? ?? ? 2020-06-29 ? ? 2020-02-25	A輪 ? ? ? ? Pre-A+輪 ? ? Pre-A輪	2.18億人民幣 ? ? ? ? 千萬級人民幣 ? ? 近億人民幣	龍磐投資 創(chuàng)新工場 辰德資本 北極光創(chuàng)投 ? 真善美嘉通投資 ? 北極光創(chuàng)投
迅敏康	2020-04-27	A輪	數(shù)千萬人民幣	翕然資本 泛洲麒翔
金匙醫(yī)學(xué)	2020-11-02 ? ? 2020-02-03	C輪 ? ? B+輪	2.3億人民幣 ? ? 5000萬人民幣	華蓋資本 杏澤資本 元生創(chuàng)投 君聯(lián)資本 ? 帆茂投資 達(dá)晨財(cái)智 君聯(lián)資本
銳翌生物	2020-02-29	戰(zhàn)略融資	未披露	張江浩成 魯信創(chuàng)投

在競爭中脫穎而出的根本是取決于測序結(jié)果的可靠程度，不同的公司采用不同的樣本處理技術(shù)、數(shù)據(jù)庫及數(shù)據(jù)分析技術(shù)，報(bào)告解讀方法各有差異，無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，臨床醫(yī)生需憑借經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行解讀。

微生物檢測服務(wù)公司如何協(xié)助臨床醫(yī)生進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀，提高診斷準(zhǔn)確度也是目前差異化競爭的核心?！疤揭蜥t(yī)學(xué)”是專注于病原微生物臨床分子診斷產(chǎn)品研發(fā)和mNGS測序服務(wù)的高科技企業(yè)，業(yè)務(wù)范圍覆蓋全國20余個(gè)區(qū)域，已與200余家三甲醫(yī)院開展合作。

參考文獻(xiàn)：

[1] 病原微生物宏基因組測序，千麥醫(yī)療

[2] 宏基因組分析和診斷技術(shù)概述，中國醫(yī)藥報(bào)

[3] 肺泡灌洗液宏基因組測序在兒童重癥肺炎支原體肺炎混合感染中的診斷價(jià)值，臨床兒科雜志

[4] 質(zhì)譜技術(shù)在病原微生物診斷中的應(yīng)用, 中國人獸共患病學(xué)報(bào)

[5] 一文看懂病原微生物檢測, 生信阿拉丁

[6] 超多重PCR技術(shù)及其在臨床病原微生物檢測的應(yīng)用，探針資本

[7] High‐Throughput Metagenomics for Identification of Pathogens in the Clinical Settings，Small Methods（探因醫(yī)學(xué)）