醫(yī)械創(chuàng)新資訊
單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorphisms, SNP)主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性，包括堿基的顛換、轉(zhuǎn)換、插入和缺失。它是人類可遺傳變異中最常見(jiàn)的一種，占所有已知多態(tài)性的90%以上。SNP作為第三代分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)、法醫(yī)物證檢驗(yàn)以及疾病診斷和治療等眾多領(lǐng)域。
一、檢測(cè)方法介紹
1、測(cè)序法
Sanger測(cè)序是DNA序列分析的經(jīng)典方法，可直接獲取核酸序列信息，是SNP檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。而且，Sanger測(cè)序可發(fā)現(xiàn)未知的 SNP位點(diǎn)，確定SNP 的突變類型和突變位置，是一種無(wú)法替代的最直接、最準(zhǔn)確的SNP檢測(cè)方法。
采用測(cè)序法檢測(cè)SNP時(shí)，首先可將含有SNP位點(diǎn)的靶標(biāo)序列通過(guò)PCR擴(kuò)增形成DNA片段后，再利用Sanger測(cè)序獲取目標(biāo)區(qū)域的核酸序列，并對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，由此即可確定是否存在變異位點(diǎn)。
Sanger測(cè)序是基于雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)末端終止的方法進(jìn)行檢測(cè)的。即在四個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)體系中，分別對(duì)應(yīng)摻入四種帶有不同顏色標(biāo)記的A、T、G、C雙脫氧核苷酸，使得核苷酸在某一固定點(diǎn)開(kāi)始延伸反應(yīng)，而延伸過(guò)程中若摻入ddNTP，則由于堿基上無(wú)3’-OH導(dǎo)致延伸無(wú)法繼續(xù)，從而隨機(jī)在某一特定堿基處終止，形成相差一個(gè)堿基的不同系列長(zhǎng)度的核酸片段，再利用毛細(xì)管電泳分離這些不同長(zhǎng)度的核酸片段，最后通過(guò)不同堿基標(biāo)記的顏色讀取待測(cè)核酸的堿基序列，由此獲得目標(biāo)區(qū)域的核苷酸序列。
? ? ? ? ? ? ? ? ??
2、TaqMan探針?lè)?/span>
TaqMan探針是一種雙標(biāo)記、自淬滅的水解探針，其5’和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，在探針結(jié)構(gòu)完整時(shí)兩者距離較近，熒光基團(tuán)的信號(hào)可被淬滅。而在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，若TaqMan探針與靶標(biāo)序列完全匹配，探針則可結(jié)合在DNA模板上，此時(shí)Taq酶延伸至探針位置時(shí)，其外切酶活性將切割水解探針，釋放熒光基團(tuán)，使得熒光信號(hào)增強(qiáng)。而且，隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增多，熒光信號(hào)越來(lái)越強(qiáng)，從而可通過(guò)儀器實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)的變化過(guò)程。
針對(duì)雙等位基因SNP，可分別設(shè)計(jì)兩種對(duì)應(yīng)的探針，只有探針與模板完全匹配時(shí)，在擴(kuò)增擴(kuò)增過(guò)程中探針可被水解產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光信號(hào)，而如果探針與靶序列之間存在錯(cuò)配，其熒光強(qiáng)度將會(huì)減弱，由此可通過(guò)熒光強(qiáng)度檢測(cè)SNP位點(diǎn)。
而由于MGB探針的長(zhǎng)度可以設(shè)計(jì)得更短，有利于提高探針的識(shí)別特異性，因此用于檢測(cè)SNP的TaqMan探針常用MGB修飾。但在測(cè)試時(shí)，需篩選測(cè)試較多的探針，探針合成成本相對(duì)較高。
3、ARMS-PCR法
擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(Amplification Refractory Mutation System PCR,ARMS-PCR)，又稱為等位基因特異性PCR(Allele-Specific PCR, AS-PCR)，是基于Taq DNA 聚合酶無(wú)法修復(fù)引物3’末端的單個(gè)堿基錯(cuò)配，從而使得擴(kuò)增受阻的檢測(cè)方法。在擴(kuò)增過(guò)程中，只有當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，才能正常延伸擴(kuò)增；而當(dāng)引物3’末端的堿基與SNP位點(diǎn)的等位基因不互補(bǔ)配對(duì)時(shí)，則不發(fā)生擴(kuò)增反應(yīng)，由此對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳或熒光PCR檢測(cè)，則可確定SNP基因型。
在ARMS-PCR基礎(chǔ)上也發(fā)展出了一些改良方法，如四引物擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng) PCR(tetra-primer amplification refractory mutation system PCR, Tetra-primer ARMS-PCR)。該方法設(shè)計(jì)了四條引物，其中兩條為3’末端位于SNP位點(diǎn)上的內(nèi)引物，兩條引物方向相反，且分屬于不同基因型；另外兩條為通用外引物，且兩條引物與SNP位點(diǎn)的距離應(yīng)不一樣。這樣，在反應(yīng)過(guò)程中，若四條引物均與模板完全匹配，則可擴(kuò)增出三種長(zhǎng)度不一的產(chǎn)物(兩條內(nèi)引物位于同一位點(diǎn)上，無(wú)長(zhǎng)片段擴(kuò)增產(chǎn)物形成)；而如果兩條內(nèi)引物中有一條引物與模板不匹配，則只形成兩種不同長(zhǎng)度的產(chǎn)物，因此，根據(jù)電泳后產(chǎn)物大小即可判斷基因型。
然而，由于凝膠電泳檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，而且開(kāi)蓋進(jìn)行產(chǎn)物分析易造成污染，因此市面上使用ARMS-PCR方法開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，大部分采用了閉管檢測(cè)的實(shí)時(shí)熒光PCR。ARMS-PCR法的熒光PCR檢測(cè)時(shí)，同樣使用TaqMan探針，只是將SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物3’末端，因此理論上只有引物3’端與模板完全匹配時(shí)，才能形成擴(kuò)增曲線；但在實(shí)際檢測(cè)時(shí)，單個(gè)堿基的錯(cuò)配依然可以延伸擴(kuò)增，只是效率較低。為了提高其特異性，有時(shí)需在靠近引物3’末端的位置人為引入錯(cuò)配堿基，以降低非靶標(biāo)序列的擴(kuò)增效率。
4、分子信標(biāo)法
分子信標(biāo)是一段雙標(biāo)記的寡核苷酸探針，其5’末端和3’末端分別標(biāo)記熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，且探針5’端和3’端的部分堿基可互補(bǔ)配對(duì)，從而形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，使得熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)相互靠近而熒光信號(hào)較低。分子信標(biāo)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)部分包含SNP檢測(cè)位點(diǎn)，當(dāng)模板與分子信標(biāo)環(huán)狀結(jié)構(gòu)的核酸序列完全匹配時(shí)，分子信標(biāo)可與模板雜交形成伸展?fàn)顟B(tài)，從而導(dǎo)致熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的空間距離拉大，熒光信號(hào)增強(qiáng)，因此可被儀器檢測(cè)，并確定SNP位點(diǎn)。
而使用不同熒光基團(tuán)標(biāo)記分子信標(biāo)，則可區(qū)分SNP類型。該方法與TaqMan探針?lè)愃?，均是通過(guò)探針中單個(gè)堿基的識(shí)別能力區(qū)分SNP。只是分子信標(biāo)采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)，而TaqMan探針使用MGB修飾，以提高探針對(duì)SNP的識(shí)別特異性。
?
5、高分辨率熔解曲法
高分辨熔解曲線分析技術(shù)(high-resolution melting analysis, HRM)是通過(guò)特定染料與擴(kuò)增后產(chǎn)物結(jié)合后形成特定的熔解峰進(jìn)行分析檢測(cè)的方法，其使用的特料為飽和熒光染料，具有更強(qiáng)的DNA結(jié)合能力，且不影響PCR擴(kuò)增，在DNA解鏈過(guò)程中也不會(huì)發(fā)生重排，使得熔解曲線具有更高的分辨率。
核酸片段的固有特性，如DNA序列的長(zhǎng)度、GC含量和堿基互補(bǔ)性差異等，均能影響高分辨率熔解曲線，而結(jié)合高精度熒光定量PCR儀，其分辨精度則可達(dá)到對(duì)單個(gè)堿基差異的區(qū)分，從而可用于確定SNP位點(diǎn)。
6、CAPS法
酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence, CAPS)，又稱限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)，是PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合的檢測(cè)方法。該方法基于DNA片段在酶切位點(diǎn)上的堿基變異，采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶，對(duì)該DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，從而產(chǎn)生不同的電泳圖譜，由此確定SNP位點(diǎn)的堿基類型。
CAPS僅能檢測(cè)位于酶切位點(diǎn)處的SNP，對(duì)于酶切位點(diǎn)以外的SNP則無(wú)法檢測(cè)。為了解決這個(gè)不足，對(duì)于那些不能采用CAPS檢測(cè)的SNP位點(diǎn)，可以使用衍生酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(derived cleaved amplified polymorphic sequence, dCAPS)進(jìn)行檢測(cè)，即通過(guò)在引物上引入錯(cuò)配堿基創(chuàng)造酶切位點(diǎn)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多態(tài)性檢測(cè)。
? ??
7、SNaPshot法
SNaPshot是美國(guó)應(yīng)用生物公司(ABI)開(kāi)發(fā)的一種商業(yè)技術(shù)，是基于熒光標(biāo)記的單堿基延伸原理，而建立起來(lái)的分型技術(shù)，該方法也被稱為小測(cè)序。其引物設(shè)計(jì)的關(guān)鍵是延伸引物的3’末端應(yīng)緊挨著SNP位點(diǎn)，同時(shí)對(duì)不同SNP位點(diǎn)可設(shè)計(jì)不同長(zhǎng)度的延伸引物，這樣便可通過(guò)引物長(zhǎng)度區(qū)分SNP位點(diǎn)。
檢測(cè)時(shí)，在一個(gè)含有測(cè)序酶和四種熒光標(biāo)記的ddNTP體系中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，由于加入的核苷酸為雙脫氧核糖核苷酸，因此引物延伸一個(gè)堿基即終止，其延伸產(chǎn)物通過(guò)測(cè)序儀檢測(cè)，根據(jù)峰移動(dòng)的位置可確定延伸產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的SNP位點(diǎn)，而根據(jù)峰的顏色則可確定SNP位點(diǎn)的堿基種類。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??
8、KASP法
KASP(Kompetitive Allele-Specific PCR)是基于引物末端堿基的特異性匹配對(duì)SNP進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法在引物和探針設(shè)計(jì)上與常規(guī)熒光PCR不同，首先需針對(duì)SNP的等位基因設(shè)計(jì)兩條對(duì)應(yīng)的上游引物，引物3’末端分別位于各自的SNP位點(diǎn)上，同時(shí)引物5’端各自帶有一段獨(dú)特的標(biāo)簽序列，而下游引物則是一條常規(guī)設(shè)計(jì)共用的引物；其次，設(shè)計(jì)兩條與上游引物標(biāo)簽序列一致的熒光探針，探針的5’端分別標(biāo)記不同的熒光基團(tuán)，同時(shí)對(duì)應(yīng)于熒光探針設(shè)計(jì)各自互補(bǔ)配對(duì)的淬滅探針，并在淬滅探針的3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。由此，在擴(kuò)增未開(kāi)始時(shí)，熒光探針與淬滅探針結(jié)合，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)相互靠近，而無(wú)法產(chǎn)生熒光信號(hào)。當(dāng)設(shè)計(jì)的上游引物中有一條或兩條與模板完全匹配時(shí)，則可啟動(dòng)擴(kuò)增，其擴(kuò)增產(chǎn)物再結(jié)合下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，則形成含有標(biāo)簽序列的DNA片段；該帶有標(biāo)簽序列的DNA片段可與熒光探針結(jié)合，而熒光探針3’端可作為引物啟動(dòng)擴(kuò)增，最后形成帶有熒光標(biāo)記的擴(kuò)增產(chǎn)物，而且熒光探針對(duì)應(yīng)的淬滅探針則在擴(kuò)增過(guò)程中被切割掉，從而使得擴(kuò)增過(guò)程的熒光信號(hào)增強(qiáng)，可對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
KASP法針對(duì)上游引物標(biāo)簽序列合成了兩個(gè)通用熒光探針和兩個(gè)通用淬滅探針，再結(jié)合不同SNP位點(diǎn)的特異性引物，則可對(duì)多個(gè)SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。
9、基因芯片法
基因芯片(gene chip)是指將大量針對(duì)SNP的寡核苷酸探針高密度地固定在一固相支持物表面，從而形成多重寡核苷酸微陣列，而經(jīng)熒光染料標(biāo)記后的待測(cè)DNA片段，與芯片上固定好的探針陣列進(jìn)行雜交反應(yīng)，核酸片段只與其序列完全互補(bǔ)配對(duì)的探針雜交，不與含有單個(gè)錯(cuò)配堿基的序列雜交，從而將目標(biāo)序列固定下來(lái)，再通過(guò)清洗去除非目標(biāo)片段，最后通過(guò)掃描檢測(cè)芯片上的熒光信號(hào)，由此確定SNP位點(diǎn)。
另外，也可將寡核苷酸引物的5’末端固定在固相支持物上, 而讓其3’末端作為引物進(jìn)行延伸反應(yīng)，且反應(yīng)體系中使用ddNTP作為原料，因此只能延伸1個(gè)堿基, 這個(gè)被延伸的堿基與SNP位點(diǎn)堿基互補(bǔ)結(jié)合, 由此可通過(guò)檢測(cè)芯片上的熒光信號(hào)確定SNP位點(diǎn)。
基因芯片法的檢測(cè)通量高，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，市面上已有多家企業(yè)可銷售SNP芯片，如ThermoFisher、Illumina和Agilent。
10、質(zhì)譜法
質(zhì)譜法是基于基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF MS)的檢測(cè)方法，其檢測(cè)過(guò)程中，需通過(guò)激光激發(fā)DNA分子片段, 再利用飛行時(shí)間判斷DNA片段的分子量大小，從而確定SNP位點(diǎn)。其檢測(cè)原理同樣使用了單堿基延伸技術(shù)，在多重PCR擴(kuò)增時(shí)，其擴(kuò)增產(chǎn)物將在SNP位點(diǎn)上終止延伸，形成不同分子量的檢測(cè)產(chǎn)物，再利用質(zhì)譜分析獲得圖譜，而不同分子量的延伸產(chǎn)物，在其對(duì)應(yīng)的分子量位置上可查看檢測(cè)峰圖，由此確定SNP位點(diǎn)。
二、總結(jié)
用于檢測(cè)SNP的方法，除了測(cè)序法可直接獲取核酸信息外，其它方法均是基于已知SNP位點(diǎn)進(jìn)行設(shè)計(jì)的檢測(cè)方法。這些方法中，有些技術(shù)在擴(kuò)增檢測(cè)原理上類似。如TaqMan探針?lè)ê头肿有艠?biāo)法均是基于探針的特異性識(shí)別來(lái)區(qū)分檢測(cè)SNP位點(diǎn)的，ARMS-PCR和KASP則是基于引物特異性識(shí)別SNP位點(diǎn)的檢測(cè)方法，SNaPshot法和質(zhì)譜法則均使用了單堿基延伸技術(shù)。
SNP檢測(cè)在遺傳疾病的診斷和篩查以及用藥種類和劑量指導(dǎo)等方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值。而2019年出現(xiàn)的新型冠狀病毒，作為一種RNA病毒，其在進(jìn)化演變過(guò)程中，也出現(xiàn)了很多SNP位點(diǎn)，其中的一些變異甚至使得新冠的傳染性和毒力存在進(jìn)一步增強(qiáng)的潛在風(fēng)險(xiǎn)，因而時(shí)不時(shí)拉響了全球疫情警報(bào)。從Alpha、Beta、Mamma到后來(lái)的Delta，再到現(xiàn)在的Omicron，面對(duì)這些需要關(guān)注的變異株(Variants of Concern, VOC)，SNP檢測(cè)方法同樣必不可少。
