新型冠狀病毒（SARS-CoV-2或2019-nCoV）威脅著全球健康，盡管它與SARS-CoV非常相似，但是傳染性卻更大。現(xiàn)有的RT-qPCR檢測(cè)方法往往需要昂貴的設(shè)備和訓(xùn)練有素的專業(yè)人員。在這種情況下，亟需開發(fā)出一種快速、準(zhǔn)確且能夠在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)病毒的方法。

2月25日，預(yù)印本網(wǎng)站?medRxiv?發(fā)布了分別由沈陽(yáng)化工大學(xué)應(yīng)用生物學(xué)研究所所長(zhǎng)尹秀山博士團(tuán)隊(duì)和美國(guó)密歇根皇家橡樹博蒙特Michael B Chancellor團(tuán)隊(duì)帶來(lái)的報(bào)告，揭示了中外科學(xué)家通過逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）技術(shù)探索出快速檢測(cè)病毒的新方法，這兩種方法不僅操作簡(jiǎn)單、能在現(xiàn)場(chǎng)使用，并且可以在45分鐘內(nèi)出檢測(cè)結(jié)果。

RT-LAMP是一種將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）以及反轉(zhuǎn)錄相結(jié)合，直接檢測(cè)出RNA的技術(shù)，當(dāng)它與反應(yīng)混合物中的pH指示劑耦合時(shí)，人們可以通過顏色的變化知道檢測(cè)結(jié)果。

iLACO可檢測(cè)出低至10個(gè)拷貝的ORF1ab基因

尹秀山博士團(tuán)隊(duì)開發(fā)出一種經(jīng)過優(yōu)化的、基于恒溫LAMP的檢測(cè)方法——iLACO（isothermal LAMP based method forCOVID-19）并對(duì)其進(jìn)行了驗(yàn)證。

https://doi.org/10.1101/2020.02.20.20025874

在研究中，研究人員制備了多個(gè)反應(yīng)物，其中包含合成ORF1ab基因序列的基因稀釋液（從1,000,000到10份拷貝），結(jié)果發(fā)現(xiàn)iLACO非常敏感，能夠檢測(cè)到低至10份拷貝的ORF1ab基因。為了進(jìn)一步擴(kuò)大iLACO的檢測(cè)能力，研究人員將新型核酸染料GeneFinderTM添加至反應(yīng)混合物中，在65℃溫育一段時(shí)間后放在藍(lán)光下，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性組肉眼可見明顯的綠色熒光，而陰性組則保持粉色不變。

陽(yáng)性組和陰性組在藍(lán)光下呈現(xiàn)不同顏色

最后，研究人員使用iLACO評(píng)估了2020年沈陽(yáng)市疫情爆發(fā)期間經(jīng)過RT-qPCR初診的43個(gè)樣本，結(jié)果顯示，97.6%（42/43）經(jīng)qPT-PCR驗(yàn)證的樣品與2 μl樣本孵育40分鐘后顯示出一致的信號(hào)，只有一個(gè)樣本在50分鐘后顏色保持不變，表明低劑量病毒會(huì)導(dǎo)致假陰性或自發(fā)性陰性信號(hào)。

目前，RT-qPCR檢測(cè)大多使用5μl樣品輸入，因此研究人員檢測(cè)了增加樣本量是否有助于檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)此時(shí)的檢測(cè)結(jié)果不一致。研究人員認(rèn)為，或許是由于使用自動(dòng)RNA提取工作站時(shí)，RNA稀釋緩沖液中存在Tris或EDTA所致，這可以通過調(diào)整所用緩沖液的濃度來(lái)優(yōu)化。

RT-LAMP 63°C下溫育30分鐘可獲最佳擴(kuò)增結(jié)果

在Michael B Chancellor團(tuán)隊(duì)帶來(lái)的報(bào)告中，研究人員使用由COVID-19武漢-湖-1（Wuhan-Hu-1）完整基因組（MN908947）的核苷酸2941-3420設(shè)計(jì)的COVID-19 PCR標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)幾種引物、溫度范圍（57-65°C）和孵育時(shí)間（15-45分鐘）進(jìn)行了檢測(cè)，確定了RT-LAMP的最佳條件。在63°C下溫育30分鐘可獲得最佳擴(kuò)增結(jié)果。

https://doi.org/10.1101/2020.02.19.20025155

研究人員對(duì)COVID-19、MERS、BtCoV以及MHV病毒進(jìn)行了系統(tǒng)特異性測(cè)試，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)僅對(duì)COVID-19的樣本有反應(yīng)，使用人體血清、尿液、唾液、口咽拭子和鼻咽拭子均可成功地完成RT-LAMP。

從左至右分別為血清、尿液、唾液、鼻咽拭子、口咽拭子的檢測(cè)結(jié)果

另外，研究人員還將RT-LAMP引物的序列與SARS和與感冒相關(guān)的冠狀病毒的序列進(jìn)行了比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些冠狀病毒與RT-LAMP引物存在27-54%的核苷酸不匹配，這表明它們不可能檢測(cè)出RT-LAMP陽(yáng)性結(jié)果。考慮到病毒可能發(fā)生突變，研究人員還檢查了RT-LAMP引物是否與來(lái)自其他地點(diǎn)的27個(gè)不同COVID-19分離株存在不匹配現(xiàn)象，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不匹配度為0。

RT-LAMP引物與其他冠狀病毒的比對(duì)結(jié)果

盡管這項(xiàng)研究存在一些局限，比如COVID-19是生物安全級(jí)別，由于無(wú)法直接檢測(cè)相關(guān)病毒而使用了來(lái)自這些病毒相同區(qū)域的核苷酸寡核苷酸，但是這些實(shí)驗(yàn)確實(shí)證明了該方法的可行性以及對(duì)COVID-19的特異性，對(duì)于潛在感染者的篩查和病毒檢測(cè)具有很大的價(jià)值。

這兩項(xiàng)研究旨在尋找到比RT-qPCR檢測(cè)更加快速、準(zhǔn)確且簡(jiǎn)單易上手的病毒檢測(cè)方法，這些方法對(duì)于社區(qū)和普通人群檢測(cè)是否感染病毒具有重要意義。